|
|
| Клиническая лабораторная диагностика |
 |
Обычные ОТ-ПЦР анализы генов, кодирующих матричный белок вирусов гриппа А (H1N1)
| Обычные ОТ-ПЦР анализы генов, кодирующих матричный белок вирусов гриппа А (H1N1)
Протокол обычный ОТ-ПЦР
Протоколы и праймеры для обычной ПЦР и гель-электрофореза продуктов с целью обнаружения вирусов гриппа типа А в образцах от людей приведены ниже. Данные протоколы показали себя достаточно эффективными для идентификации вирусов гриппа типа А, когда использовались с указанными реагентами и праймерами. Лабораториям, у которых имеются ограничения в отношении идентификации циркулирующих в настоящее время вирусов, рекомендуется связаться с одной из референс-лабораторий-ВОЗ по диагностике инфекции гриппа А/H5 или с одним из Сотрудничающих центров ВОЗ по гриппу для получения помощи от них в определении оптимальных для использования праймеров.
Необходимые материалы
• Мини набор «QIAamp® Viral RNA» (QIAGEN, Cat#52904. После надлежащей оценки могут использоваться другие наборы для выделения).
• Набор One-Step RT-PCR (QIAGEN, Cat#210212)
• Ингибитор РНКазы 20 ед/мкл (Applied Biosystems, Cat#8080119)
• Без-РНКазная вода
• Этанол (96-100%)
• Микроцентрифуга (регулируемая до 13000 оборотов в минуту)
• Регулируемые пипетки
• Стерильные без-РНКазные наконечники для пипеток с аэрозольным фильтром
• Вортекс
• Пробирки для микроцентрифугрования (0.2, 1.5 мл.)
• Термоциклер (ПЦР-аппарат)
• Наборы праймеров
• Положительный контроль (может быть получен по запросу, направленному в Сотрудничающий центр ВОЗ по гриппу, функционирующий на базе Центров по контролю и профилактике заболеваний - CDC, Атланта, США)
Праймеры
Ген: М
Последовательности праймеров
M30F2/08: 5`- ATGAGYCTTYTAACCGAGGTCGAAACG -3`
M264R3/08: 5`- TGGACAAANCGTCTACGCTGCAG -3`
Ожидаемый размер продукта - 244 п.о. (ссылка: NIID )
Процедура
1. Выделите вирусную РНК из клинического образца посредством мини набора «QIAamp® Viral RNA» или эквивалентного ему набора для выделения РНК в соответствии с инструкцией производителя.
2. Выполните однораундовую ОТ-ПЦР
• Достаньте реагенты из хранилища, нагрейте их до комнатной температуры. После того, как они оттаяли, храните их на льду
• Приготовление мастер-микса (работайте на льду)
• Добавьте следующие компоненты в пробирку для микроцентрифугирования и осторожно перемешайте, набирая мастер-микс в пипетку и высвобождая ее 10 раз (Замечание: для предотвращения локальных различий в концентрации солей, важно обеспечить полное перемешивание раствора перед использованием)
Реакция без Q-раствора
Вода (молекулярно-биологического
качества ) 9,5 мкл
5х QIAGEN ОТ-ПЦР буфер 5,0 мкл
дНТФ смесь 1,0 мкл
Прямой праймер (10 мкмоль/л) 1,5 мкл
Обратный праймер (10 мкмоль/л) 1,5 мкл
Ферментная смесь 1,0 мкл
Ингибитор РНКазы (20 ед/мкл) 0,5 мкл
Общий объем 20 мкл
• Добавьте 20 мкл мастер-микса в каждую пробирку для ПЦР
• Добавьте 5 мкл РНК-образца в мастер-микс. Для контрольных реакций используйте 5 мкл без-РНКазной воды для негативного контроля и 5 мкл соответствующей вирусной РНК - для положительного контроля
• Запрограммируйте термоциклер в соответствии с условиями термического циклирования
• Запустите программу ОТ-ПЦР, при этом пробирки для ПЦР должны еще находиться на льду. Дождитесь, пока термоциклер нагреется до 50оС. Затем поместите пробирки для ПЦР в термоциклер.
Условия термического циклирования
Обратная транскрипция 30 мин, 50°C
Начальная ПЦР-активация 15 мин, 95°C
Трехступенчатое циклирование
Денатурация 30 сек, 94 °C
Отжиг 30 сек, 50 °C
Элонгация 1 мин, 72 °C
Кол-во циклов 45
Финальная элонгация 10 мин, 72 °C
Хранение 4 °C ∞
3. Агарозный гель-электрофорез продуктов ОТ-ПЦР
Подготовьте агарозный гель, загрузите продукты ПЦР и маркер молекулярного веса и запустите в соответствии со стандартными протоколами. Визуализируйте наличие маркера под ультрафиолетом. Пример требующегося материала и процедуры приведен ниже
Необходимые материалы
• Форма для заливки агарозного геля и камера для электрофореза
• Источник питания
• Трансиллюминатор (λ = 302 nm)
• Фотоаппарат и плёнка Polaroid или компьютер, соединённый с камерой
• Вариопипетки
• 2% агарозный гель в ТАЕ буфере 1 х
• 1х ТАЕ буфер
• Бромид этидия (10мг/мл)
• Буфер для гельэлектрофореза (GLB) 6х
• Маркер молекулярного веса
Процедура
А) Приготовление агарозного геля
i) поместите форму с гелем на основу для заливки гелей. Вставьте гребенку и выровняйте основу.
ii) приготовьте 2% раствор агарозы путём взвешивания 4 граммов агарозы и разведите в 200 мл 1х ТАЕ буфера. Приготовьте агарозу путём нагревания в микроволновой печи.
iii) охладите расплавленую агарозу примерно до 60 °C, затем добавьте 10 мкл бромида этидия.
iv) вылейте расплавленную агарозу в форму для заливки геля.
v) дайте гелю застыть при комнатной температуре.
vi) извлеките гребенку из формы.
vii) установите форму в камеру для электрофореза расположив лунками со стороны катодов.
viii) заполните камеру для электрофореза 1× TAE до уровня, который закроет гель с верхом.
B) Внесение образцов:
i) добавьте по 5 мкл буфера для внесения образцов в гель в каждую ПЦР-пробирку.
ii) внесите маркер молекулярного веса в первую лунку геля.
iii) пипеткой внесите в каждую лунку геля по 15 мкл ПЦР-продукта / буфера для внесения образцов.
iv) закройте крышку на камере и присоедините электроды. Проведите гельэлектрофорез в течение 30-35 минут при напряжении 100 вольт.
v) с помощью трансиллюминатора визуализируйте присутствие дорожек маркера и ПЦР-продуктов.
vi) путём фотосъёмки задокументируйте картинку с гелем.
Интерпретация результатов
Размер полученных ПЦР-продуктов должен быть сравним с ожидаемым размером. Если тест проходит без использования положительного контроля, полученные продукты необходимо подтвердить путём секвенирования и сравнения с имеющимися последовательностями.
|
|
|
| Просмотров: 1574
|
|
|