|
|
| Клиническая лабораторная диагностика |
 |
Кишечные протозойные инвазии. Лабораторная диагностика
| Основные методы лабораторной диагностики
Приготовление и микроскопирование мазков . Во всех случаях обследований на зараженность простейшими кишечника обязательным является приготовление и изучение нативных мазков и препаратов, окрашенных раствором Люголя. Для этого на предметное стекло на расстоянии 2- 4 см друг от друга разными пипетками наносится по 0,1 мл (2 капли) физиологического раствора и раствора Люголя. Деревянной палочкой (одной и той же) готовят гомогенную полупрозрачную взвесь исследуемого материала сначала в капле изотонического раствора, а затем в растворе Люголя. Каждую каплю накрывают чистым покровным стеклом. При наличии в испражнениях патологических примесей (слизь, кровь) их исследуют в мазке с изотоническим раствором. Жидкий прозрачный материал (водянистые испражнения, дуоденальное содержимое) можно исследовать без изотонического раствора, нанося 2 - 3 капли его на предметное стекло и покрыв их покровным стеклом. При исследовании плотного, оформленного кала, в котором могут содержаться только цисты простейших, микроскопируются лишь препараты, окрашенные раствором Люголя. Просматривается вся площадь мазков сначала под малым (8 x10), а затем под более сильным увеличением (10 х 60). В каждом случае нужно промикроскопировать 2 - 3 препарата из разных мест имеющейся пробы. При сомнительных и отрицательных результатах для окончательного заключения требуется произвести не менее 3 анализов на протяжении 1 - 2 недель.
Методы консервации.Если исследование в день взятия материала невозможно (главным образом при массовых обследованиях), можно применять консерванты по Сафаралиеву или Берроузу.
Состав консерванта Сафаралиева: метиленовый синий - 0,2 г, 2% раствор сернокислого цинка - 82,5 мл, формалин концентрированный - 10 мл, уксусная кислота крепкая - 5 мл, фенол кристаллический - 2,5 г. Реактивы смешивают в указанном порядке. Фенол предварительно расплавляют на водяной бане.
Консервант разливается во флакончики до половины их объема. Подлежащий исследованию материал от каждого больного немедленно эмульгируется отдельной деревянной палочкой в отдельном флакончике в количестве, составляющем примерно 1/3 объема консерванта. Простейшие окрашиваются уже через 5 - 10 мин и при необходимости могут сохраняться в течение нескольких месяцев. Для исследования каплю осадка со дна пробирки с помощью пипетки помещают на предметное стекло и покрывают покровным. Микроскопируют при увеличении 10х60 или 10х40. Иммерсионную систему используют в случае необходимости изучить объект более детально. Консервировать можно как оформленный кал, так и жидкие патологические субстраты. В смеси длительно сохраняются и хорошо окрашиваются не только цисты, но и вегетативные формы амеб и других простейших.
Консервант Берроуза имеет следующий состав: хлорид натрия - 0,7 г, формалин концентрированный - 5,0 мл, спирт этиловый 96о - 12,5 мл, фенол кристаллический - 2,0 г, вода дистиллированная - до 100 мл. Консервирование в нем производится таким же образом, как и в растворе Сафаралиева. Простейшие сохраняются в этом консерванте не дольше одного месяца. Для микроскопического исследования каплю осадка эмульгируют на предметном стекле в капле красящего раствора и покрывают покровным стеклом.В качестве красящего раствора используется 0,01% раствор тионина, азура или метиленового синего.
Метод обогащения. При скудном содержании простейших в кале они могут быть не обнаружены при микроскопировании нативных мазков и мазков с раствором Люголя. В этих случаях рекомендуется применить формалин-эфирное обогащение. Для этого кусочек кала величиной с горошину тщательно эмульгируют деревянной палочкой в центрифужной пробирке в 6 мл 10% раствора формалина на изотоническом растворе. В пробирку добавляют 2 мл эфира, закрывают резиновой пробкой, энергично встряхивают в течение 1 мин, а затем центрифугируют 3 мин при 1500 об/мин или 1 мин при 2500 об/мин. После центрифугирования эмульсия разделяется на четыре слоя: окрашенный в желтый цвет верхний эфирный слой, слой фекалий (фекальная пробка), затем слой формалина и под ним осадок, в котором содержатся цисты простейших. Деревянной палочкой (отдельной для каждой пробы) слой фекалий отделяют от стенок пробирки и все содержимое ее, за исключением осадка, сливают. Наклонив пробирку отверстием книзу, быстро протирают ее стенки ватным или марлевым тампоном, стараясь удалить возможно большее количество жидкости, но не затрагивая осадок. Переворачивают пробирку отверстием вверх, переносят отдельной пипеткой осадок на предметное стекло, эмульгируют его в капле раствора Люголя и исследуют по обычной методике.
В случае необходимости приготовленную эмульсию можно хранить в закрытой резиновой пробкой пробирке до 2 сут.
В процессе приготовления центрифугата даже некоторые цисты простейших частично подвергаются деструкции. Вегетативные же их формы при этом совершенно разрушаются. Поэтому указанный метод непригоден для обнаружения трихомонад и диэнтамеб, которые не образуют цист, а также для исследования жидкого стула, в котором цисты отсутствуют.
Метод приготовления постоянных препаратов, окрашенных по Гейденгайну. Иногда в нативных мазках или в мазках с раствором иода точно определить вид простейшего не удается. Постоянные препараты, окрашенные по Гейденгайну, благодаря выявлению тонких структурных особенностей, позволяют распознавать простейших как по вегетативным формам, так и по цистам.
Для изготовления препаратов пригоден материал любой консистенции. Из жидкого стула мазки должны быть изготовлены сразу после дефекации. Обычно готовят не менее двух препаратов.
Процесс приготовления препаратов можно разделить на несколько этапов.
Фиксация:
- Концом деревянной палочки исследуемый кал тонким слоем быстро наносится на предметное или покровное стекло (следить, чтобы материал не подсох). Мазок погружают в фиксирующую жидкость Шаудина, налитую в чашку Петри. Жидкость состоит из 2 частей насыщенного раствора сулемы (8,5: 100; растворять при нагревании) и одной части 96о спирта-ректификата,к которым добавляется ледяная уксусная кислота (3-5% к общему объему жидкости). Мазки фиксируются 15 - 20 минут.
- Мазки переносятся в 70о спирт на 5 мин.
- Для окончательного удаления сулемы препараты помещаются на 5 - 10 минут в спирт-иод (в 70о спирт добавляется несколько капель настойки иода до светло-коричневого цвета ).
г) Для удаления иода препараты выдерживаются в 70о спирте 5 мин. Если окраска не может быть произведена сразу, то их можно сохранять в спирте несколько дней.
Протрава и окраска:
- Перед окраской - промывка дистиллированной водой - 3 мин.
- Протрава в 2 - 3% водном растворе железо-аммиачных квасцов в течение 4-20 часов( в зависимости от температуры).Кристаллы квасцов должны быть слабо фиолетового цвета; желтые не пригодны.
- Быстрое (1-3 сек.) споласкивание в дистиллированной воде.
- Перенос для окраски в 0,5% раствор гематоксилина. Для его
приготовления 1,0 г кристаллическюго гематоксилина растворяют в
10 см3 96о спирта, добавляют 90 см3 дистиллированной воды и выдерживают 10 - 20 дней. За 4-24 часа перед употреблением разводят наполовину дистиллированной водой.
- Промывка перекрашенного препарата водой в течение 10 - 20 мин.
Дифференцирование:
- Для извлечения избытка краски препарат помещают в 0,5 - 1% раствор железо-аммиачных квасцов и следят за обесцвечиванием до появления серо-лилового фона окраски препарата. На этом дифференцировку заканчивают, не доводя обесцвечивание до коричневого и желтого фона, что указывает на излишнее удаление краски, вследствие чего препараты становятся негодными.
- Промывка в водопроводной воде (лучше проточной) 2О - 40 мин.
Обезвоживание, просветление и заделка препарата:
- Помещение препарата последовательно в 70о, 85о и 96о спирты, на 2 - 3 мин в каждый.
- Перенос в карбол-ксилол (25 грамм кристаллической карболовой кислоты растворить в 75 куб. см. ксилола) на 2 мин.
- Выдержать в чистом ксилоле 1 мин.
- На препарат поместить каплю канадского бальзама и накрыть покровным стеклом. Если при заделке в канадский бальзам появляется муть, значит обезвоживание было недостаточно и его надо повторить, заменив карбол-ксилол свежим.
Постоянные препараты, изготовленные таким методом, сохраняются без изменений годами. Он позволяет проводить совершенно точную диагностику простейших и дифференцйровать их от различных псевдопротозойных образований, часто наблюдаемых в кале, которые при недостаточном опыте могут быть приняты за вегетативные формы или цисты простейших.
Метод культивирования. Эффективным дополнительным методом диагностики в ряде случаев является метод культивирования. Рекомендуются следующие среды, наиболее простые по составу и дающие удовлетворительные результаты для культивирования дизентерийных амеб и других простейших кишечника (за исключением лямблий):
- Простая сывороточная среда - смесь из 9 частей стерильного изотонического раствора (0,85%) и 1 части нормальной лошадиной (или бычьей) сыворотки, разлитая в пробирки по 8 - 10 мл.
- Двухфазная сывороточная среда - на 19 частей бычьей сыворотки добавляют 1 часть мясопептонного бульона с 2% раствором глюкозы. Можно использовать также сыворотки других животных и остатки сывороток человека, поступающих в лабораторию для диагностических исследований. Смесь свертывают при 80оС в течение 2 ч в косом положении, охлаждают, а затем заливают стерильным изотоническим раствором так, чтобы он перекрывал на 1 см верхний край скоса.
- Среда Павловой - хлорида натрия 8,5 г, двузамещенного фосфорно-кислого натрия 0,59 г, однозамещенного фосфорно-кислого калия 0,45 г, дистиллированной воды 1000 мл. После стерилизации в автоклаве (30 мин при давлении 1,5 атмосферы) и охлаждения в раствор добавляют стерильную лошадиную (или бычью) сыворотку в соотношении 1:20 и разливают среду в стерильные пробирки по 5 - 7 мл.
- Среда Райса представляет собой смесь 1 части мясопептонного бульона с 4 частями изотонического раствора, к которой добавляется нативная лошадиная или бычья сыворотки в соотношении 1:10. Среду стерильно разливают в пробирки по 8 - 10 мл.
Могут быть использованы и другие, более сложные по составу среды.
Для получения первичных культур простейших в пробирки со средой, предварительно проверенные на стерильность выдерживанием в термостате при температуре 37о С в течение суток (или при комнатной температуре 3 сут.), вносится комочек оформленного кала величиной с горошину или 2 - 3 капли жидкого материала. Смесь гомогенизируют встряхиванием. Засевать одновременно нужно несколько пробирок (2 - 3). Перед посевом пробирки со средами подогревают до температуры 37оС и в каждую добавляют 1 - 2 петли рисового крахмала.Его предварительно стерилизуют сухим жаром при температуре 90о С по 1 часу 4 дня подряд в пробирках, закрытых ватными пробками.
Оптимальной температурой для культивирования является 37оС. Результаты проверяются через каждые 24 ч в течение 5 сут. Для проверки со дна пробирки с помощью пипетки забирают каплю осадка с небольшим количеством жидкости, помещают на предметное стекло, покрывают покровным стеклом и микроскопируют.
Иммунологические методы. Эти методы еще недостаточно разработаны, но находят все более широкое применение, которое сдерживается, главным образом�, из-за отсутствия централизованного производства сывороток и антигенов. Наиболее часто применяется реакция непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ), а также реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), иммуноферментного анализа (ИФА), связывания комплемента (РСК), преципитации и некоторые другие.
Микрометрия. Размеры простейших и их ядер имеют важное значение для определения вида. Измерение производится при помощи окулярного микрометра представляющего собой линейку длиной 5 мм или 1 см с делениями, соответствующими 0,1 мм. Линейка нанесена на стекло, вмонтированное или вставляемое временно в окуляр микроскопа. Значение делений окулярного микрометра по отношению к измеряемым объектам для разных систем микроскопов и разных объективов предварительно определяется при помощи объектмикрометра. Он представляет собой линейку с делениями в 0,01 мм (10 мкм) на предметном стекле. Объектмикрометр помещают под объектив микроскопа и совмещают его линейку с линейкой окулярного микрометра. Устанавливают, какое число делений окулярного микрометра точно совпадает с определенным числом делений объектмикрометра. По этим данным вычисляют значение одного деления окулярной линейки в микронах или микрометрический коэффициент. Например, 10 делений окулярного микрометра соответствуют 2 делениям объектмикрометра. Тогда значение одного деления (микрометрический коэффициент) составит (2х10)/10=2мкм. Вычисление микрометрического коэффициента производят с точностью до десятых или (реже) сотых долей микрона. Для измерения какого-либо микроскопического объекта следует заменить обычный окуляр на микрометрический (или вставить в него микрометрическую линейку), определить в делениях последнего длину и ширину объекта (клетки простейшего, ее ядра) и, перемножив число делений на микрометрический коэффициент, найти размеры объекта в микронах. Точно так же измеряются другие объекты: яйца и личинки паразитических червей, псевдопротозойные образования и др.
|
|
|
| Просмотров: 1801
|
|
|