Высокоспецифичные методы определения креатинина
Проблемы, связанные с невысокой специфичностью реакции Яффе, побудили к
поиску более специфичных методов. Наибольший интерес представляют
ферментативные или частично ферментативные методы с использованием: (1)
креатининазы (КФ 3.5.4.21), также называемой креатининиминогидролазой
или деиминазой, катализирующей расщепление креатинина до иона аммония и
N-метилгидантоина и (2) креатинингидролазы (КФ 3.5.2.10), также
называемой креатининамидогидролазой, катализирующей гидролиз креатинина
до креатина (рис. 3).
В частично ферментативных, ранних вариантах автоматизированных и
неавтоматизированных методов, использовали эти ферменты, или в
сочетании, или раздельно. Их использовали для разрушения креатинина и
определения разницы между общим количеством Яффе-реагирующих хромогенов
(до добавления фермента) и остающихся в среде «некреатининовых»
Яффе-реагирующих хромогенов (после добавления фермента). Данные методы
позволяют оценить истинное содержание креатинина в материале.
Для определения креатинина использовали иммобилизированный фермент
креатининазу в сочетании с ион-селективным электродом, чувствительным к
ионам аммония. Поскольку методы, основанные на данной реакции,
чувствительны как к эндогенному аммиаку и креатинину, так и к аммиаку в
окружающей среде и реактивах, потребовалось введение дополнительных
реакций, позволяющих вывести из реакции ионы аммония и поддерживать
стабильный уровень кофермента НАДФН2 .
Был предложен полностью ферментативный метод, в котором креатинин
гидролизуют до креатина, который определяют в креатинкиназной реакции
(рис. 4).
Скорость индикаторной реакции в данной сопряженной системе ферментов
контролируется спектрофотометрически при длине волны 340 нм или в
равновесном, или кинетическом варианте. Метод используют как для
неавтоматизированного определения, так и для определения с помощью
автоанализаторов [17].
Для устранения влияния аммиака при определении креатинина используют
методы с использованием креатининамидогидролазы для превращения
креатинина в креатин. Креатин превращают в саркозин, который окисляется
саркозиноксидазой до глицина, формальдегида и перекиси водорода (рис.
4). Содержание перекиси водорода определяют количественно в
пероксидазной реакции, интенсивность окраски среды зависит от
концентрации креатинина в образце [18–20].
Референтный метод для определения креатинина в сыворотке включает
массспектрометрию с изотопным разведением. В данном методе применяют
ионообенную ВЭЖХ с фотометрией при 234 нм [21].
Количественное определение креатинина может быть проведено с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии [22].
Другие методы определения креатинина включают реакцию креатинина с
3,5-динитробензойной кислотой (ДНБК) или ее производными [23],
1,4-нафтохинон-2-сульфонатом или o-нитробензальдегидом [24].
Реакция креатинина с ДНБК была использована в технологии «сухой» химии.
В этом методе креатинин реагирует с ДНБК с образованием окрашенного
комплекса. Реакция оценивается с помощью отражательной фотометрии при
560 нм [25] .
Зависимость референтных интервалов от метода определения креатинина
Уровень креатинина сыворотки человека зависит от двух основных
факторов: скорости образования и скорости выведения. Поскольку
источником креатинина в сыворотке является креатин и креатинфосфат
мышечной ткани, большая мышечная масса сопровождается более высоким
содержанием креатинина в сыворотке. На практике эти различия выявляют
при сравнении результатов определения креатинина у мужчин, женщин и
детей. Индивидуальные колебания уровня креатинина сыворотки у здоровых
взрослых располагаются между 4 и 6 % [26].
Второй, и намного более существенный, фактор, отвечающий за уровень
креатинина в сыворотке — скорость его выделения почками. Для оценки
почечной функции определение клиренса креатинина является более
чувствительным показателем, чем уровень креатинина в сыворотке.
Определение креатинина в моче проводят для определения клиренса
креатинина или для оценки полноты собирания суточного объема мочи.
В ряде исследований было обнаружено существенное колебание количества
креатинина, экскретируемого почками ежедневно. В частности,
внутрииндивидуальный коэффициент вариации может достигать 10 % [27] .
Выделение креатинина с мочой пропорционально мышечной массе, при
расчете на килограмм мышечной массы экскретируется около 0,5 ммоль
креатинина. Характер питания, объем мочи и физическая активность не
сказываются существенно на уровне креатинина сыворотки. Физическая
нагрузка незначительно увеличивает выведение креатинина с мочой, а у
людей с недостатком белка в пище выведение креатинина уменьшается [28].
Колебание количества выделенного с мочой креатинина может быть связано
с экзогенным креатинином, попадающим с пищей. Этим объясняют колебания
величины клиренса креатинина от 15 до 20 % у одного и того же человека.
Выделение креатинина уменьшается с возрастом. Величина клиренса у
пожилых увеличивается незначительно, поскольку уменьшение выделения
креатинина с мочой частично компенсируется снижением образования
креатинина в результате уменьшения мышечной массы.
Поскольку большинство современных методов определения креатинина в
плазме крови, основанных на реакции Яффе, обладают различной
специфичностью, референтные интервалы зависят от того, насколько
правильно был определен уровень креатинина.
При использовании более специфичных (ферментативных) методов
определения креатинина в плазме референтные интервалы обычно на 10–25
ммоль/л (0,1–0,3 мг/100мл) ниже по сравнению с обычно используемыми
методами.
Референтные интервалы [29]
При использовании реакции Яффе:
Сыворотка (плазма):
мужчины — 62–115 мкмоль/л (0,7-1,2 мг/100мл);
женщины — 53–97 мкмоль/л (0,6-1,1 мг/100мл).
Выделение креатинина с мочой:
мужчины — 124–230 мг/кг/сутки (14–26 мг/кг/сутки);
женщины — 97–177 ммоль/кг/сутки (11–20 мг/кг/сутки).
При использовании ферментативного метода:
мужчины — 55–96 мкмоль/л (0,62–1,1 мг/100мл);
женщины — 40–66 мкмоль/л (0,45–0,75 мг/100мл).
Дети до 12 лет [30]:
сыворотка — 22–75 мкмол$ь/л (0,25 –0,85 мг/100 мл);
моча — (0,5 ммоль/л)/кг мышечной ткани (0,057 г).
|
